三种大鼠骨髓间充质干细胞源性人工肝组织的构建与评价

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.41.004

中国组织工程研究 ›› 2014, Vol. 18 ›› Issue (41): 6578-6584.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2014.41.004

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三种大鼠骨髓间充质干细胞源性人工肝组织的构建与评价

俞建雄¹，袁静²，许瑞云³

武汉大学人民医院，¹胃肠外科，²眼科中心，湖北省武汉市 430060；³中山大学附属第三医院肝胆外科，广东省广州市 510630

修回日期:2014-09-10 出版日期:2014-10-01 发布日期:2014-10-01
通讯作者: 俞建雄，博士后，武汉大学人民医院胃肠外科，湖北省武汉市 430060
作者简介:俞建雄，男，1974年生，江西省婺源县人，中山大学附属第三医院博士后，武汉大学人民医院胃肠外科医师，主要从事外科组织修复与重建研究。
基金资助:
国家自然科学基金资助项目(81100664)；武汉市青年科技晨光计划项目(2014070404010222)；武汉大学自主科研基金资助项目(2042014kf0259)

Three kinds of engineered hepatic tissues constructed using rat bone marrow mesenchymal stem cells

Yu Jian-xiong¹, Yuan Jing², Xu Rui-yun³

¹Department of Gastrointestinal Surgery, Renmin Hospital of Wuhan University, Wuhan 430060, Hubei Province, China; ²Eye Center, Renmin Hospital of Wuhan University, Wuhan 430060, Hubei Province, China; ³Department of Hepatobiliary surgery, the 3^rd Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University, Guangzhou 510630, Guangdong Province, China

Revised:2014-09-10 Online:2014-10-01 Published:2014-10-01
Contact: Yu Jian-xiong, Department of Gastrointestinal Surgery, Renmin Hospital of Wuhan University, Wuhan 430060, Hubei Province, China
About author:Yu Jian-xiong, M.D., Physician, Department of Gastrointestinal Surgery, Renmin Hospital of Wuhan University, Wuhan 430060, Hubei Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81100664; Wuhan Science and Technology Dawn Project, No. 2014070404010222; Wuhan University Independent Research Project, No. 2042014kf0259

摘要/Abstract

摘要：

背景：人工肝组织有可能为治疗急性肝衰竭提供一种新的选择，但人工肝组织的构建存在着种子细胞、支架、培养模式及对人工肝组织营养获取调控等各方面的难题。

目的：体外构建3种人工肝组织，筛选最佳人工肝组织以供移植用。

方法：纯化、扩增并诱导分化骨髓间充质干细胞为肝样细胞，在Transwell培养体系中分别与去细胞羊膜、DACRON PATCH心血管外科补片、生物外科补片3种支架结合构建3种人工肝组织，培养3 d后进行形态学和功能学检测。

结果与结论：密度梯度离心结合贴壁法可获得较高纯度的大鼠骨髓间充质干细胞，并在体外转分化为肝样细胞。在构建的3种人工肝组织中，肝样细胞与生物外科补片支架材料可获得最大程度结合，并具有更强的尿素合成能力和白蛋白分泌功能，为治疗急性肝衰竭提供了实验基础。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

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关键词: 干细胞, 骨髓干细胞, 急性肝衰竭, 骨髓间充质干细胞, 人工肝组织, Transwell系统, 羊膜, DACRON PATCH心血管外科补片, 生物外科补片, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Engineered hepatic tissue is considered a promising strategy for healing acute liver failure. But, there are series of hindrances in the construction of engineered hepatic tissues, including acquisition of vital hepatocytes, choice of scaffolds and culture system, and nutrition supply.

OBJECTIVE: To construct three kinds of engineered hepatic tissues in hope to screen the optimal one for transplantation in acute liver failure.

METHODS: After purification, amplification, bone marrow mesenchymal stem cells were induced to differentiate into hepatocyte-like cells which were co-cultured with acellular amniotic membrane, DACRON PATCH cardiovascular surgical patch, biological surgical patch, respectively to construct three kinds of engineered hepatic tissues. After 3 days of culture, morphological and functional detections were performed.

RESULTS AND CONCLUSION: Rat bone marrow mesenchymal stem cells with higher purity were successfully harvested by using density gradient centrifugation and adherent methods, and then the cells were differentiated into hepatocyte-like cells. In the three kinds of engineered hepatic tissues, hepatocyte-like cells were found to be combined with the biological surgical patch to the maximum extent, and their combination exhibited stronger ability of urea synthesis and albumin secretion, which provides experimental basis for treatment of acute liver failure.

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Key words: bone marrow, mesenchymal stem cells, liver failure, acute, liver, artificial

中图分类号:

R394.2

俞建雄，袁静，许瑞云. 三种大鼠骨髓间充质干细胞源性人工肝组织的构建与评价[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(41): 6578-6584.

Yu Jian-xiong, Yuan Jing, Xu Rui-yun. Three kinds of engineered hepatic tissues constructed using rat bone marrow mesenchymal stem cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(41): 6578-6584.

图/表（结果） 2

2.1 SD大鼠骨髓间充质干细胞的分离、纯化、扩增及标记 在倒置相差显微镜下，可观察有核细胞在培养瓶底散在分布；3 d后首次换液，可见有少量贴壁细胞；5-9 d后细胞成集落式生长，呈明显的长梭形；10-13 d后原代细胞融合成单层排列有明显方向性，细胞排列成漩涡状、网状、辐射状。

细胞经传代培养后，细胞生长较快，4-7 d即可汇合成单层，原代和传代骨髓间充质干细胞形态及生长特点无明显改变。流式细胞仪分析第3代骨髓间充质干细胞的表型，结果显示，骨髓间充质干细胞具有较高的均一性，流式细胞仪检测表型为CD29(99.8%)、CD44(62%)阳性，而CD34(1.8%)、CD45(2.5%)为阴性，也不表达CD80(6.8%)和CD86(2.1%)两种重要的共刺激分子，见图1。

共聚焦显微镜下观察可见全部细胞标记后胞膜均显红色荧光，证实CM-DiI标记阳性率为100%，见图2。

2.2 骨髓间充质干细胞的转分化 骨髓间充质干细胞转分化组中，可见细胞由梭形向三角形或椭圆形或圆形转变；细胞体积增大，并且相互集聚，形成小梁状排列，类似肝小叶结构；诱导3周后，细胞小梁样排列逐渐模糊，细胞发生凋亡。转分化细胞在第14天行免疫荧光检测，发现肝细胞标记物白蛋白和甲胎蛋白均为阳性表达，其中红色为CM-DiI标记荧光，绿色为肝细胞标记物的FITC染色荧光；而对照组细胞共聚焦显微镜下观察肝细胞标记物白蛋白和甲胎蛋白为阴性(图3)。RT-PCR结果证实了转分化过程，诱导组细胞在不同时间段白蛋白和甲胎蛋白的mRNA均有阳性表达，其中在第7天出现少量白蛋白的mRNA表达，随诱导时间的延长，其表达量逐渐增强，21 d时呈最强表达；甲胎蛋白的mRNA在14 d时表达量最强，21 d时表达量有所降低。而未诱导组白蛋白、甲胎蛋白的mRNA未见明显表达。表明转分化的肝样细胞是介于胚肝细胞和成熟肝细胞之间的尚未完全终末化的类肝样细胞。

2.3 人工肝组织支架的透射电镜观察 透射电镜下可见支架1板层纤维排列规则，相邻板层间纤维走向相互垂直；透射电镜下可见支架3由相互交叉排列的纤维状结构组成，部分胶原纤维组织出现降解现象(图4)；而支架2因材料的特殊性在透射电镜下无法观察。

2.4 人工肝组织的构建及评估 细胞在支架1和2的表面生长，其中在支架1生长良好，细胞数量较多，细胞与基质的黏附性好；而在支架2上细胞数量很少，形态欠佳且与支架黏附疏松。相比而言，在支架3中，细胞不仅在表层，而且在内层中顺纤维基质排列生长，呈多角形或圆形，形成多层细胞结构(图5)。

尿素合成实验和白蛋白分泌实验也证实人工肝组织3具有更强的功能，与人工肝组织1和人工肝组织2相比差异有显著性意义(P < 0.05及P < 0.01)，为最佳人工肝组织(图6)。

参考文献

[1] Zhao P, Wang C, Liu W, et al. Causes and outcomes of acute liver failure in China.PLoS One. 2013;8(11):e80991.
[2] Romero M, Palmer SL, Kahn JA, et al. Imaging appearance in acute liver failure: correlation with clinical and pathology findings. Dig Dis Sci. 2014;59(8):1987-1995.
[3] Willars C.Update in intensive care medicine: acute liver failure. Initial management, supportive treatment and who to transplant. Curr Opin Crit Care. 2014;20(2):202-209.
[4] Bernal W, Wendon J.Acute liver failure.N Engl J Med. 2013; 369(26):2525-2534.
[5] Wang DW, Yin YM, Yao YM.Advances in the management of acute liver failure.World J Gastroenterol. 2013;19(41): 7069-7077.
[6] Whitehouse T, Wendon J.Acute liver failure.Best Pract Res Clin Gastroenterol. 2013;27(5):757-769.
[7] Lee WM.Recent developments in acute liver failure.Best Pract Res Clin Gastroenterol. 2012;26(1):3-16.
[8] Lee WM.Acute liver failure.Semin Respir Crit Care Med. 2012;33(1):36-45.
[9] Canbay A, Tacke F, Hadem J, et al.Acute liver failure: a life-threatening disease.Dtsch Arztebl Int. 2011;108(42): 714-720.
[10] Sundaram V, Shaikh OS.Acute liver failure: current practice and recent advances.Gastroenterol Clin North Am. 2011; 40(3): 523-539.
[11] Chen SC, Mullon C, Kahaku E,et al.Treatment of severe liver failure with a bioartificial liver.Ann N Y Acad Sci. 1997;831: 350-360.
[12] Hoyer DP, Munteanu M, Canbay A,et al.Liver transplantation for acute liver failure: are there thresholds not to be crossed? Transpl Int. 2014;27(6):625-633.
[13] Rai R.Liver transplantatation- an overview.Indian J Surg. 2013; 75(3):185-191.
[14] Struecker B, Raschzok N, Sauer IM.Liver support strategies: cutting-edge technologies.Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 2014;11(3):166-176.
[15] Bañares R, Catalina MV, Vaquero J.Liver support systems: will they ever reach prime time?Curr Gastroenterol Rep. 2013;15(3):312.
[16] Nevens F, Laleman W.Artificial liver support devices as treatment option for liver failure.Best Pract Res Clin Gastroenterol. 2012;26(1):17-26.
[17] Rozga J, Malkowski P.Artificial liver support: quo vadis.Ann Transplant. 2010;15(4):92-101.
[18] Kobashi-Margáin RA, Gavilanes-Espinar JG, Gutiérrez-Grobe Y, et al.Albumin dialysis with molecular adsorbent recirculating system (MARS) for the treatment of hepatic encephalopathy in liver failure.Ann Hepatol. 2011;10 Suppl 2:S70-76.
[19] Rademacher S, Oppert M, Jörres A.Artificial extracorporeal liver support therapy in patients with severe liver failure.Expert Rev Gastroenterol Hepatol. 2011;5(5):591-599.
[20] Yu Y, Fisher JE, Lillegard JB, et al. Cell therapies for liver diseases.Liver Transpl. 2012;18(1):9-21.
[21] Ohashi K.Liver tissue engineering: The future of liver therapeutics.Hepatol Res. 2008;38 Suppl 1:S76-87.
[22] Cusick RA, Lee H, Sano K,et al.The effect of donor and recipient age on engraftment of tissue-engineered liver.J Pediatr Surg. 1997;32(2):357-360.
[23] Török E, Pollok JM, Ma PX,et al.Hepatic tissue engineering on 3-dimensional biodegradable polymers within a pulsatile flow bioreactor.Dig Surg. 2001;18(3):196-203.
[24] Riccalton-Banks L, Liew C, Bhandari R,et al.Long-term culture of functional liver tissue: three-dimensional coculture of primary hepatocytes and stellate cells.Tissue Eng. 2003; 9(3):401-410.
[25] Ogawa K, Ochoa ER, Borenstein J,et al.The generation of functionally differentiated, three-dimensional hepatic tissue from two-dimensional sheets of progenitor small hepatocytes and nonparenchymal cells.Transplantation. 2004;77(12): 1783-1789.
[26] Sudo R, Mitaka T, Ikeda M,et al.Reconstruction of 3D stacked-up structures by rat small hepatocytes on microporous membranes.FASEB J. 2005;19(12):1695-1697.
[27] Soto-Gutierrez A, Navarro-Alvarez N, Rivas-Carrillo JD,et al.Construction and transplantation of an engineered hepatic tissue using a polyaminourethane-coated nonwoven polytetrafluoroethylene fabric.Transplantation. 2007;83(2): 129-137.
[28] Ohashi K, Yokoyama T, Yamato M,et al.Engineering functional two- and three-dimensional liver systems in vivo using hepatic tissue sheets.Nat Med. 2007;13(7):880-885.
[29] Turner WS, Schmelzer E, McClelland R,et al.Human hepatoblast phenotype maintained by hyaluronan hydrogels.J Biomed Mater Res B Appl Biomater. 2007;82(1):156-168.
[30] Underhill GH, Chen AA, Albrecht DR,et al.Assessment of hepatocellular function within PEG hydrogels.Biomaterials. 2007;28(2):256-270.
[31] Kadota Y, Yagi H, Inomata K,et al.Mesenchymal stem cells support hepatocyte function in engineered liver grafts. Organogenesis. 2014;10(2):268-277.
[32] Jiang WC, Cheng YH, Yen MH,et al.Cryo-chemical decellularization of the whole liver for mesenchymal stem cells-based functional hepatic tissue engineering.Biomaterials. 2014;35(11):3607-3617.
[33] Monsel A, Zhu YG, Gennai S,et al.Cell-based Therapy for Acute Organ Injury: Preclinical Evidence and Ongoing Clinical Trials Using Mesenchymal Stem Cells.Anesthesiology. 2014 Sep 10. [Epub ahead of print]
[34] V Volarevic V, Nurkovic J, Arsenijevic N,et al.Concise review: therapeutic potential of mesenchymal stem cells for the treatment of acute liver failure and cirrhosis.Stem Cells. 2014; 32(11):2818-2823.
[35] Esrefoglu M.Role of stem cells in repair of liver injury: experimental and clinical benefit of transferred stem cells on liver failure.World J Gastroenterol. 2013;19(40):6757-6773.
[36] Russo FP, Parola M.Stem cells in liver failure.Best Pract Res Clin Gastroenterol. 2012;26(1):35-45.
[37] Chistiakov DA.Liver regenerative medicine: advances and challenges.Cells Tissues Organs. 2012;196(4):291-312.
[38] Jiankang H, Dichen L, Yaxiong L,et al.Preparation of chitosan-gelatin hybrid scaffolds with well-organized microstructures for hepatic tissue engineering.Acta Biomater. 2009;5(1):453-461.
[39] Libera RD, Melo GB, Lima Ade S,et al.Assessment of the use of cryopreserved x freeze-dried amniotic membrane (AM) for reconstruction of ocular surface in rabbit model.Arq Bras Oftalmol. 2008;71(5):669-673.

引言

急性肝功能衰竭(acute liver failure, ALF)是以广泛肝细胞损伤坏死为病理学基础，以快速进展的肝性脑病和严重的肝功能损害为临床特征，涉及多脏器的严重不可逆性疾病，死亡率高达70%-80%^[1-10]。目前急性肝功能衰竭尚缺乏有效的治疗手段，研究表明药物等能够一定程度上挽救濒临死亡的肝细胞^[11]，但已经死亡的肝细胞却不能再生。原位肝移植是目前临床治疗急性肝功能衰竭最有效的方法，能够提高存活率至50%-60%^[12-13]，但供肝短缺、合理安排供肝、移植肝再感染、终身服用免疫抑制剂及手术高额费用，决定了其难以广泛应用。人工肝支持系统(artificial liver support system, ALSS)是一种替代治疗方法^[14-17]，其中非生物人工肝支持系统包括血液透析、炭和树脂血液灌注、血和血浆交换、MARS和prometheus，虽已广泛使用，但未证实其能确切有效提高急性肝功能衰竭的生存率^[18-19]。以体外培养的肝细胞为核心的生物学人工肝支持系统则是理想的人工肝治疗方法，但受肝细胞来源、生物反应器的选择和性能、高费用以及其治疗过程中再出血等弊端制约其发展。另一种手段则是肝细胞移植技术，也因存在细胞来源、细胞活力及移植细胞疗效的滞后性影响其应用^[20]。积极寻找安全有效、费用低廉的新型治疗手段已成为当务之急。人工肝组织(engineered hepatic tissue, EHT)片的构建随之应运而生^[21]。

起初大多数学者研究人工肝组织主要目的在于优化人工肝支持系统^[22-26]，直至2007年，Soto-Gutierrez等^[27]采用多聚氨基甲酸酯包被的聚四氟乙烯纤维组织接种并培养肝细胞3 d后，治疗急性肝功能衰竭裸鼠，发现可以显著提高裸鼠存活率，开创了真正意义上人工肝组织的移植治疗试验。之后，各种人工肝组织的研究尤其是支架的研究得以迅速发展^[28-32]。目前构建人工肝组织的主要困难在于：种子细胞的获得、支架的选择、培养模式及对人工肝组织营养调控等方面，其中尤以种子细胞获得为主要制约因素。

如前所述，人工肝组织和人工肝支持系统的核心问题在于获取足够数量具有生物活性的肝细胞，然而，受供体短缺及细胞活力等制约，需求新型来源细胞成为上述治疗措施的瓶颈。近年随着干细胞的研究深入，骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)因其来源丰富、取材方便、多分化潜能、低免疫原性等特点，成为最好的种子细胞，众多研究均表明，在有或无严重肝损伤存在的情况下，植入的骨髓间充质干细胞均成功分化成肝细胞/肝卵圆细胞^[33-37]，参与肝脏的再生，具有成熟肝细胞的功能，甚至可以缓解遗传性缺陷所致的代谢性肝脏疾病。

因此，本研究就骨髓间充质干细胞在体外诱导为肝样细胞并构建人工肝组织作初步探索，旨在探讨构建骨髓间充质干细胞源性人工肝组织的可行性，为后期治疗急性肝功能衰竭奠定实验基础。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
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材料方法

设计：体外细胞与组织实验。

时间及地点：实验于2007年1至10月在中山大学中山眼科中心实验室完成。

材料：

实验动物：幼龄健康雄性SD大鼠，体质量100-150 g，均购于中山大学动物实验中心。

实验用材料和试剂：肝素、胎牛血清，低糖 DMEM (L-DMEM)培养基购自美国GLBCO BRL公司；Percoll购自美国Pharmacia公司；ELISA试剂盒购自美国R&D公司；CD29、CD34、CD44、CD45、CD80、CD86荧光标记单抗均购自美国BD公司；DACRON PATCH心血管外科补片由强生公司提供；生物外科补片由广东冠昊公司提供。

实验方法：

大鼠骨髓间充质干细胞的分离、纯化、扩增、鉴定及标记：取SD大鼠，处死后于无菌条件下获取大鼠的股骨和胫骨，冲洗骨髓液，相对密度为1.073的Percoll密度梯度离心法分离骨髓单个核细胞，以1×10⁸L^-¹细胞浓度接种培养于低血清L-DMEM培养基，至贴壁对接度达80%-90%以上时传代培养，并依次标记为第0，1，2代等，直至第10代。消化离心第3代骨髓间充质干细胞，制成单细胞悬液，免疫荧光标记法进行以下标记：CD29-FITC、CD34-PE、CD44-FITC、CD45-PE-CY5、CD80-PE、CD86-PE-CY5，鼠IgG-FITC、PE、PE-CY5作阴性对照，暗室室温孵育 25 min，多聚甲醛固定，以流式细胞仪计数阳性细胞；按 3 mg/L CM-DiI标记骨髓间充质干细胞，共聚焦显微镜检测标记效果。

大鼠骨髓间充质干细胞的转分化：将CM-DiI标记的骨髓间充质干细胞按1×10⁸ L^-¹细胞浓度接种至6孔培养板中，分两组实验，实验组加入诱导培养基(间充质干细胞培养基内含体积分数为10%胎牛血清、20 μg/L肝细胞生长因子、10 μg/g表皮生长因子)，对照组加入基础培养基(间充质干细胞培养基内含体积分数为10%胎牛血清)，于37 ℃，体积分数为5%CO₂培养箱里静置培养，每3 d换液1次，连续培养21 d，分别于7，14，21 d收集标本进行倒置相差显微镜观察、免疫荧光检测和RT-PCR分析。

免疫荧光检测：于诱导培养14 d获取细胞标本，纯丙酮固定，非免疫性动物血清封闭，行抗鼠白蛋白、甲胎蛋白单克隆抗体免疫细胞化学鉴定，共聚焦显微镜下观察并拍照；阴性对照用非免疫血清代替一抗。

RT-PCR检测：分别诱导培养第7，14，21天获取细胞标本，离心去上清后，采用Trizol RNA一步法提取RNA，10-50 μL DEPC水重悬后，一步法RT-PCR，在50 μL的反应体系中加入白蛋白与甲胎蛋白的RT-PCR上、下游引物各3 μL，0.5 μg的RNA模板。β-actin为内参，各基因反应引物及条件见表1，反应完毕，2%琼脂糖凝胶中常规电泳，凝胶成像仪上拍照。

人工肝组织支架的准备：

去细胞羊膜基质(支架1)：无菌状态下取健康产妇剖腹产胎盘，钝性分离羊膜，去掉海绵层结缔组织后，平铺于硝纤膜上后，加入0.02%EDTA作用2 h，刮除羊膜上皮层，然后平铺在聚碳酸酯膜(polycarbonate membrane，PET)表面并固定。

贝朗公司心血管补片(DACRON PATCH)(支架2)及广东冠昊生物科技公司的生物外科补片(支架3)：在无菌条件下，分别将DACRON PATCH及生物外科补片平铺在聚碳酸酯膜表面并固定。

3种支架的电镜观察：将上述3种支架切成3 mm× 1 mm×1 mm的小条，2.5%戊二醛固定，梯度丙酮脱水，环氧树脂Epon812包埋，常规超薄切片，醋酸双氧铀及枸橼酸铅双染色，JEM1200EX透射电镜下观察并拍照。

人工肝组织的构建与评价：将转分化2周的肝样细胞(约2×10⁶)接种至预先铺有上述3种支架的Transwell 24孔培养板中，培养3 d后取出标本，分别进行共聚焦显微镜观察、扫描电镜学形态学检测、尿素合成功能及白蛋白分泌能力检测，以确定构建人工肝组织的最佳支架。依照支架顺序依次命名为人工肝组织1、2和3。

形态学评估：共聚焦显微镜下观察细胞在支架表层及其纵切面生长情况；将上述3种支架切成3 mm×1 mm× 1 mm的小条，2.5%戊二醛固定，梯度乙醇脱水，临界点干燥3 h左右后金属镀膜，扫描电镜观察组织表面细胞的结构并拍照。

功能学检测：按Soto-Gutierrez等^[27]方法分别行人工肝组织尿素合成能力检测及白蛋白分泌功能检测。具体步骤如下：体外培养第3天时，进行换液，换液量为2 mL，在培养液中加入10 mol/L的NH₄Cl继续培养24 h后收集上清液，在CL-800全自动生化仪上测定尿素含量；绘制白蛋白的标准曲线后，以ELISA方法检测人工肝组织培养液中白蛋白的分泌量，以人工肝组织1结果为100%，比较3组人工肝组织尿素合成能力，以评价3种骨髓间充质干细胞源性人工肝组织的功能水平。

主要观察指标：SD大鼠骨髓间充质干细胞的分离、纯化、鉴定、扩增及其转分化；并行3组人工肝组织的构建，利用电镜及尿素生成实验评估筛选最佳人工肝组织。

统计学分析：采用SPSS 13.0软件进行统计学处理。计量资料均采用x(_)±s表示，组间差异采用完全随机设计资料的方差分析，检验水准α=0.05。

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讨论

1997年，Cusick等^[22]在评估供受者年龄对移植肝细胞的存活能力中采用多孔多聚乳酸基质为支架承载肝细胞移植入受体的网膜内，开始了人工肝组织构建的研究。起初大多数学者研究人工肝组织主要目的在于优化人工肝支持系统。直至2007年，Soto-Gutierrez等^[27]采用多聚氨基甲酸酯包被的聚四氟乙烯纤维组织接种并培养肝细胞3 d后，治疗急性肝功能衰竭裸鼠，发现可以显著提高裸鼠存活率，开创了真正意义上人工肝组织的移植治疗实验。之后，各种人工肝组织的研究尤其是支架的研究得以迅速发展。

支架是再生医学与组织工程中一个不可或缺的组成部分，除了具备良好的生物相容性和生物降解性，支架还需具有以下特点：①一个稳定的三维空间，模仿肝的组织结构。②促血管生成功能，以保证人工肝组织足够的营养和氧气供给，并及时清除代谢毒物。③高度多孔结构，以便器官再生^[38]。迄今为止，两种类型的支架发展比较迅速：一是天然支架，即利用机体内自身组织，如Turner等^[29]利用透明质酸水凝胶制作的人工胎肝干细胞组织，其优点在于能够利用支架与细胞的相互作用，缺点则在于其缺乏良好的机械强度，不便于操作；另一种则是由高分子生物材料组成，如Underhill等^[30]用聚乙烯乙二醇制作的人工肝组织，其缺点是制作的支架缺乏良好的三维空间结构，不利于模拟以及肝组织再生。

本实验中选用3种支架，去细胞羊膜、DACRON PATCH和生物外科补片。其中，去细胞羊膜是一种天然高分子材料，含有丰富的营养因子，如表皮生长因子、转化生长因子β、白细胞介素和胶原蛋白，广泛应用于人工角膜制造^[39]。DACRON PATCH是由聚酯尿烷纤维制成的管状人造血管，广泛应用于心脏血管外科手术，如动脉重建和心脏修复。而生物外科补片，则是从猪中提取新鲜组织坚韧支架，经专利技术和蛋白组学及低温干燥等多重技术处理后，除具有极好的生物组织相容性和低免疫原性等特性外，还具有强大的机械强度，其制作目的是期望成为临床疝修补手术的最佳材料。实验结果发现：在Transwell三维培养体系中，去细胞羊膜由于质地致密，只能作为单层平板支架，细胞只能平铺并堆积于其接触面上，难以发挥理想的解毒功能，且羊膜过于菲薄，难以达到移植所需的材料厚度；DACRON PATCH心血管补片虽有一定的厚度，但细胞在其上的黏附性差，细胞无法在支架表面长期存活，且材料过于致密，细胞无法生长于支架深层，难以达到移植所需的细胞量；相比之下，生物外科补片，透射电镜检查可发现其中降解的胶原纤维样结构，在Transwell三维培养体系中，适当大小的微孔有利于细胞进入并沿胶原样纤维结构分布和“定居”，适当的厚度能有效保证移植细胞的数量，细胞在支架中能够形成较为稳定的具有三维立体结构的人工肝组织。通过尿素合成及白蛋白分泌实验进一步证实了第3种支架的优越性，为后期进行移植治疗急性肝功能衰竭提供了良好的支架选择。

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[1]	林清凡, 解一新, 陈婉清, 叶振忠, 陈幼芳. 人胎盘源间充质干细胞条件培养液可上调缺氧状态下BeWo细胞活力和紧密连接因子的表达[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(在线): 4970-4975.
[2]	蒲锐, 陈子扬, 袁凌燕. 不同细胞来源外泌体保护心脏的特点与效应[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(在线): 1-.
[3]	张秀梅, 翟运开, 赵杰, 赵萌. 类器官模型国内外数据库近10年文献研究热点分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(8): 1249-1255.
[4]	王正东, 黄娜, 陈婧娴, 郑作兵, 胡鑫宇, 李梅, 苏晓, 苏学森, 颜南. 丁酸钠抑制氟中毒可诱导小胶质细胞活化及炎症因子表达增多[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1075-1080.
[5]	汪显耀, 关亚琳, 刘忠山. 提高间充质干细胞治疗难愈性创面的策略[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1081-1087.
[6]	万然, 史旭, 刘京松, 王岩松. 间充质干细胞分泌组治疗脊髓损伤的研究进展[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1088-1095.
[7]	廖成成, 安家兴, 谭张雪, 王倩, 刘建国. 口腔鳞状细胞癌干细胞的治疗靶点及应用前景[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1096-1103.
[8]	谢文佳, 夏天娇, 周卿云, 刘羽佳, 顾小萍. 小胶质细胞介导神经元损伤在神经退行性疾病中的作用[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1109-1115.
[9]	李珊珊, 郭笑霄, 尤冉, 杨秀芬, 赵露, 陈曦, 王艳玲. 感光细胞替代治疗视网膜变性疾病[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1116-1121.
[10]	焦慧, 张一宁, 宋雨晴, 林宇, 王秀丽. 乳腺癌类器官研究进展及临床应用前景[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1122-1128.
[11]	王诗琦, 张金生. 中医药调控缺血缺氧微环境对骨髓间充质干细胞增殖、分化及衰老的影响[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1129-1134.
[12]	曾燕华, 郝延磊. 许旺细胞体外培养及纯化的系统性综述[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1135-1141.
[13]	孔德胜, 何晶晶, 冯宝峰, 郭瑞云, Asiamah Ernest Amponsah, 吕飞, 张舒涵, 张晓琳, 马隽, 崔慧先. 间充质干细胞修复大动物模型脊髓损伤疗效评价的Meta分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1142-1148.
[14]	侯婧瑛, 于萌蕾, 郭天柱, 龙会宝, 吴浩. 缺氧预处理激活HIF-1α/MALAT1/VEGFA通路促进骨髓间充质干细胞生存和血管再生[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 985-990.
[15]	史洋洋, 秦英飞, 吴福玲, 何潇, 张雪静. 胎盘间充质干细胞预处理预防小鼠毛细支气管炎[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 991-995.